Basi Scientifiche per Linee Guida

10.0 DIREZIONI FUTURE (prima parte)

10.1 Aspetti anatomo-patologici: evoluzione di un paradigma
10.2 Caratterizzazione biomolecolare
10.3 Diagnostica per immagine
10.4 Nuove strategie terapeutiche


10.1 Aspetti anatomo-patologici: evoluzione di un paradigma

Il ruolo dell’anatomia patologica è stato da sempre cruciale nella gestione clinica del paziente con carcinoma del polmone. Tradizionalmente, tale contributo viene identificato nel confezionamento della diagnosi anatomo-patologica, che vede nel referto istopatologico il momento culminante nel quale vengono riassunte tutte le informazioni essenziali alla gestione terapeutica del paziente.
Questo assunto è particolarmente vero, se si considera che la moderna terapia oncologica è basata sulla valutazione di fattori prognostici (eventi attesi come il tasso di recidiva e di mortalità) e di fattori predittivi (risposta della malattia ai diversi trattamenti terapeutici).
La corretta diagnosi di cancro, che può talvolta essere difficile considerando che l’Organizzazione Mondiale della Sanità ha identificato almeno 47 differenti categorie di cancro del polmone (1) (vedi cap. 3.1), è il presupposto per studi epidemiologici, molecolari, clinici e tassonomici, ma deve essere continuamente arricchita di nuovi contenuti che tengano conto del progredire delle nostre conoscenze, se si vuole che sia veramente utile per il paziente e non un mero e ripetitivo esercizio compilativo.
Ci si può chiedere, addirittura, se l’istopatologia tradizionale sia una sorgente imperfetta ed esaurita di informazione predittiva e prognostica e se la personalizzazione della terapia e l’identificazione di nuovi fattori predittivi, prognostici e diagnostici non siano invece appannaggio della moderna medicina molecolare. Pertanto, accanto alla tradizionale attività diagnostica sta emergendo una nuova figura di patologo molecolare, che dovrebbe correlare i profili geno-fenotipici dei tumori con i parametri clinico-patologici pertinenti, identificando con ciò bersagli adeguati da utilizzare per migliorare non solo l’aspetto diagnostico, ma soprattutto il trattamento dei pazienti. Sebbene spesso suddivisi in carcinomi a piccole e non a piccole cellule, i carcinomi del polmone rivelano un’inaspettata e complessa eterogeneità che rappresenta la prima difficoltà che il patologo si trova a dover spiegare (1). Questa eterogeneità è appena intravvedibile con l’esame citologico (esame diagnostico di I livello, talora di screening) ed è solo parzialmente risolvibile con l’esame istopatologico di piccoli frammenti bioptici (ad esempio ottenuti in corso di broncoscopia) che spesso consentono solo una dicotomica distinzione tra carcinomi a piccole e non a piccole cellule (esame diagnostico di II livello). Solo dall’esame del pezzo operatorio emerge tutta quella completezza d’informazione che consente il corretto inquadramento diagnostico del paziente. Il referto anatomo-patologico deve pertanto contenere adeguate informazioni caratterizzanti l’istotipo tumorale (può essere utile l’esame immunoistochimico con l’uso di marcatori polmone-specifici in casi dubbi), la radicalità dell’escissione chirurgica (attraverso l’analisi dei margini di resezione) e lo stadio di malattia valutato mediante l’uso combinato dell’esame macroscopico e microscopico (possono essere utili colorazioni immunoistochimiche per svelare la presenza di micrometastasi nei linfonodi resecati assieme al pezzo operatorio). L’uso di una terminologia per categorie diagnostiche ben codificate è un prerequisito essenziale per poter ottenere informazione prognostica e predittiva su base individuale utilizzando un’insieme di dati clinici, genetici ed istopatologici (1). La maggiore accuratezza diagnostica così conseguita ci regala una migliore comprensione della malattia da un lato ed una maggiore utilizzabilità clinica delle informazioni rese disponibili dall’altro.
Nell’ottica di tracciare le direzioni future e le sfide in tema di cancro del polmone possiamo identificare due momenti salienti nell’ambito di quel flusso biunivoco di informazioni che deve sussistere tra patologo da un lato e clinico (oncologo medico, chirurgo, radioterapista) dall’altro. In questo mutuo e fattivo scambio di informazioni è insito il concetto d’evoluzione di un paradigma, cioè di un modello d’interpretare ed approcciare il cancro del polmone che sta rapidamente e forse irreversibilmente cambiando.
In una prospettiva di prossimo futuro, è sicuramente di prima spettanza dell’anatomia patologica il migliore rifinimento diagnostico/classificativo delle lesioni preneoplastiche/preinvasive (displasia squamosa, iperplasia adenomatosa atipica) e di alcune categorie di carcinomi iniziali, in particolare l’adenocarcinoma bronchioloalveolare (BAC) (2,3). Questo è particolarmente vero, se consideriamo che il miglioramento delle tecniche identificative della presenza di lesioni iniziali (broncoscopia a fluorescenza, tomografia assiale computerizzata o ad emissione di positroni), soprattutto in una logica di programmi d’anticipazione diagnostica o di vero e proprio screening, porterà necessariamente ad identificare lesioni sempre più piccole e precoci, che dovranno essere caratterizzate al meglio per ottenere informazioni clinicamente rilevanti ai fini terapeutici o per studi di chemioprevenzione.
Individuare il potenziale d’evoluzione delle lesioni preneoplastiche/preinvasive verso neoplasie infiltranti (soprattutto per quanto riguarda la meno conosciuta delle due, l’iperplasia adenomatosa atipica vista come lesione preinvasiva o di adenocarcinoma iniziale/in situ, la cui rilevanza clinica e biologica in noduli resecati chirurgicamente è ancora indefinita), come pure migliorare la riproducibilità diagnostica intra- ed inter-osservatore sono senza dubbio obiettivi prioritari da raggiungere e consolidare in un prossimo futuro. Da una semplice interpretazione morfologica basata sull’architettura del tumore (adenocarcinoma acinare, solido, papillare, bronchioloalveolare) o sugli aspetti citologico-strutturali (adenocarcinoma mucinoso, a cellule ad anello con castone, a cellule chiare, adenocarcinoma fetale), si sta passando ad un’interpretazione per così dire più dinamica, che veda una concatenazione di eventi causali (adenocarcinoma misto) secondo un concetto di rilevanza prognostica e di pertinenza istogenetica. Sappiamo infatti che la maggior parte degli adenocarcinomi invasivi del polmone riconoscono un antecedente in situ rappresentato dal BAC (1,2), con un comportamento clinico che è intermedio tra i tumori puramente invasivi (tubulari, papillari e solidi) e quelli interamente preinvasivi (BAC) (1,4). Tale categoria di adenocarcinoma misto è prognosticamente eterogenea nella misura in cui è presente una variabile componente BAC vis à vie con quella invasiva, per cui gli sforzi si stanno concentrando nella definizione del concetto di microinvasione o di adenocarcinoma precoce (early adenocarcinoma) (5,6), in analogia con altri distretti dell’organismo in cui tale entità si è affermata (mammella, stomaco). Accanto a modelli descrittivi di adenocarcinoma iniziale (5), lo sforzo maggiore sta andando nella definizione di definire criteri oggettivi che consentano di definire il rischio individuale di progressione di malattia parametrato su categorie prognostiche conosciute, attraverso misurazioni "oggettive" del grado di infiltrazione stromale (6) o del diametro della fibrosi stromale centrale (7,8).
Il problema maggiore è stilare linee guida diagnostiche le più oggettive possibili per quantificare le dimensioni della cicatrice centrale; per distinguere il collasso alveolare (presente nei BAC puri) dalla reazione stromale (presente nei foci d’invasione degli adenocarcinomi misti); per accertare l’invasione vascolo-linfatica (marcatori degli endoteli linfatici e vascolari); per definire il numero minimo di inclusioni da analizzare per singolo tumore (auspicabilmente tutta la lesione, per diametri fino a 3 cm) che può tuttavia, divenire un problema se parte del tumore viene criopreservato per studi genetici o molecolari; fino a predeterminare il numero ed il tipo delle sezioni da analizzare per singola inclusione. Cominciamo a capire attualmente che anche i rimanenti carcinomi non a piccole cellule sono neoplasie piuttosto eterogenee dal punto di vista clinico-patologico, talvolta esprimentesi con entità a prognosi particolarmente severa quand’anche in stadio iniziale di malattia (carcinomi sarcomatoidi, carcinoma basaloide, carcinoma neuroendocrino a grandi cellule), talaltra con entità a prognosi intrinsecamente favorevole con lunga aspettativa di vita (carcinomi squamosi ilari precoci).
Una migliore caratterizzazione biopatologica ed una maggiore attenzione a queste lesioni con particolare riguardo agli aspetti istogenetici (transizione epitelio-mesenchimale nei carcinomi sarcomatoidi) e diagnostico-patogenetici (carcinoma neuroendocrino a grandi cellule e carcinoma squamoso ilare precoce) rappresenteranno importanti obiettivi dell’anatomia patologica nel prossimo futuro. Attualmente, i criteri prognostici più rilevanti nel carcinoma del polmone continuano ad essere lo stadio patologico (9), ed alcuni parametri morfologici come l’istotipizzazione (1,2), il grado di differenziazione della neoplasia (10), l’invasione vascolare (11), la percentuale di componente BAC ed il diametro della cicatrice centrale negli adenocarcinomi, l’invasione pleurica e la presenza di versamento pleurico (1,2), mentre i fattori molecolari (seppure fondamentali per capire la cancerogenesi e la progressione neoplastica polmonare) non sono ancora del tutto operativi per prendere decisioni terapeutiche al di là di alcuni aspetti riguardanti la terapia recettoriale (ad esempio, le mutazioni di EGFR).
L’integrazione dei dati morfologici con i dati molecolari ottenuti da studi di proteomica, di espressione genica e di regolazione epigenetica (metilazione, microRNA), soprattutto se ottenuti da popolazioni cellulari pure, estratte con tecniche di microdissezione, da differenti parti di neoplasie di fatto eterogenee, può portare all’identificazione di famiglie di geni coinvolti nella differenziazione dei vari istotipi neoplastici, nella loro prognosi, nella risposta ai farmaci, arrivando fino a potenziali proposte di classificazione o di stadiazione biologica che saranno senza dubbio le sfide del prossimo futuro.
Altri campi di sviluppo delle nostre conoscenze sul cancro del polmone, ai quali il patologo può dare il suo contributo, sono lo studio dei polimorfismi genetici (per l’identificazione di fattori individuali di suscettibilità alla malattia), la caratterizzazione delle cellule staminali neoplastiche (per creare modelli da utilizzare ai fini terapeutici ed alla comprensione della malattia) ed infine la messa a punto di innovativi sistemi di diagnosi precoce basati sull’uso di traccianti biologici rilasciati dalle cellule neoplastiche o dall’interazione tra ospite e tumore e riscontrabili nel sangue periferico (identificazione di acidi nucleici circolanti come DNA (12) od RNA (13) o di marcatori genetici tumore-associati (14)).
L’affermarsi di programmi d’anticipazione diagnostica, anche nel nostro Paese, porterà alla necessità di caratterizzare al meglio, sia dal punto di vista diagnostico che molecolare, le neoplasie in fase iniziale e di attuare protocolli di chemioprevenzione per cercare d’interrompere la progressione delle lesioni iniziali (secondo la teoria delle modificazioni sequenziali morfologiche e molecolari).
L’uso di sistemi di arricchimento cellulare basati sulla microdissezione LASER-guidata di frammenti bioptici o l’isolamento della frazione di cellule mononucleate dal sangue periferico andrà sempre di più affermandosi nell’ambito di protocolli di farmacogenomica, non solo per capire le basi molecolari d’azione di nuovi e vecchi farmaci, ma anche per massimizzare gli effetti terapeutici nel singolo paziente. Un’attività che dovrà essere potenziata nel prossimo futuro, costituendo un obiettivo prioritario della moderna anatomia patologica, è la messa a punto di banche di campioni tessutali criopreservati comprendenti il tumore primario e le sue eventuali metastasi, campioni tessutali normali (polmone, bronco, linfonodi), sangue periferico (plasma e componente cellulata) e secrezioni biologiche (espettorato). Questo tipo di attività, che già attualmente si svolge all’interno di alcuni laboratori di anatomia patologica, dovrà trovare nel prossimo futuro un ulteriore e deciso sviluppo, ma necessiterà di adeguati finanziamenti per coprire la complessa gestione di tali operazioni.
L’attività clinica influenza continuamente quella del patologo. La disponibilità di nuove tecniche di diagnosi clinica preoperatoria (tomografia ad emissione di positroni associata a tomografia assiale computerizzata, broncoscopia a fluorescenza, citologia agoaspirativa in corso di broncoscopia o transesofagea) porterà probabilmente ad una progressiva riduzione della necessità di biopsie linfonodali a scopo diagnostico maggiormente traumatiche (mediastinoscopia), se non nell’ambito della necessità di disporre di un’adeguata quantità di cellule tumorale nell’ambito di protocolli di farmacogenomica o di studi di espressione genica.
Le tecniche di diagnosi precoce avranno un impatto nell’identificazione delle lesioni preneoplastiche obbligando il patologo ad adeguare le proprie categorie diagnostiche. L’attivazione di studi clinici controllati nei pazienti con cancro del polmone (ad esempio, utilizzanti specifici inibitori di recettori di fattori di crescita associati o meno a chemioterapia) comporterà un coinvolgimento sempre più forte dell’anatomia patologica per le necessità di caratterizzazione immunoistochimica (assetto recettoriale) e molecolare (ricerca di mutazioni specifiche), da effettuarsi sui campioni tessutali.
Abbattere il tasso di mortalità da cancro del polmone e migliorare la qualità della vita dei pazienti saranno gli obiettivi prioritari del prossimo futuro, cui l’anatomia patologica potrà dare valido e fattivo contributo.


10.2 Caratterizzazione biomolecolare

Lo sviluppo, in questi ultimi anni, di nanotecnologie ad alta processività e la possibilità di correlare le alterazioni genomiche ed i profili genomici e proteomici dei tumori con numerosi parametri clinico-patologici, mediante innovativi metodi biostatistici, stanno fornendo nuovi ed importanti contributi per una più profonda comprensione del processo neoplastico.
I risultati finora ottenuti suggeriscono che l’impiego delle nuove nanotecnologie possa permettere di affrontare con successo complesse problematiche diagnostiche, aiutare a definire la prognosi dei pazienti e la responsività dei tumori ai trattamenti farmacologici.
In campo diagnostico, sin dai primi studi è emerso che l’analisi del profilo di espressione tumorale mediante cDNA microarrays poteva permettere di classificare le neoplasie polmonari, in termini molecolari. La suddivisione dei tumori in base ai profili di espressione non solo riproduce a grosse linee la classificazione morfologica, ma può permettere di affinarla consentendo la sottoclassificazione di istotipi in entità correlate con il grado di differenziazione e l’aggressività tumorale (15-17). Più recentemente, è stato dimostrato che mediante cDNA microarrays è possibile distinguere profili di espressione appartenenti a neoplasie istologicamente simili sviluppatesi in organi diversi come ad esempio, i carcinomi squamocellulari polmonari e i carcinomi squamocellulari insorti primariamente nel tratto testa-collo (18). Ciò potrebbe risultare utile per distinguere le neoplasie polmonari primitive da quelle metastatiche.
Anche l’ibridazione genomica comparata usando microarrays di cromosomi artificiali batterici potrebbe fornire utili informazioni per un più accurato inquadramento diagnostico del carcinoma polmonare e la diagnosi differenziale tra forme primitive e secondarie.
Per quanto concerne la valutazione prognostica, vari studi condotti con tecniche basate sui cDNA microarrays hanno permesso di identificare profili di espressione genica significativamente correlati con la prognosi, sia nell’ambito dei tumori polmonari in senso lato, sia, con dati più consistenti, nel contesto degli adenocarcinomi (15,17,19). A proposito di questo particolare istotipo, i risultati di vari studi indipendenti indicano che con analisi microarray è possibile identificare sottoclassi di adenocarcinoma caratterizzate da specifici profili di espressione genica con diverso significato biologico e prognostico. In particolare, è stata identificata una classe di adenocarcinomi, con profili di espressione genica neuroendocrina, associata statisticamente a una prognosi sfavorevole. Inoltre sono stati ottenuti degli indici di rischio, basati sui livelli di espressione di clusters genici, validati poi su casistiche indipendenti (20,21). Anche analisi genomiche basate su ibridazioni comparate (CGH, comparative genomic hybridization) e proteomiche effettuate tramite elettroforesi quantitativa bidimensionale su gel di poliacrilamide e spettrometria di massa hanno evidenziato associazioni tra alterazioni geniche o proteiche e l’evoluzione della patologia neoplastica polmonare (22-24). L’associazione di tecniche genomiche e proteomiche ad alta processività per lo studio dei profili di espressione potrebbe in un prossimo futuro risultare particolarmente efficace. Risultati pubblicati molto recentemente suggeriscono che anche l’analisi dei microRNA, piccole molecole con funzione regolatoria dell’espressione genica, possa essere particolarmente utile per la caratterizzazione delle neoplasie polmonari e per orientare in senso prognostico. Infatti, un’analisi effettuata usando microarrays di microRNA ha dimostrato particolari profili di espressione in grado di discriminare tra tessuto polmonare normale e neoplastico e di selezionare pazienti con adenocarcinoma polmonare in stadio precoce destinati a ripresa di malattia (25). La possibilità di esaminare quantitativamente l’espressione dei microRNA mediante real-time RT-PCR potrebbe permettere una selezione rapida ed accurata di questi pazienti.
Alcune osservazioni suggeriscono che le nuove tecnologie ad alta processività possano risultare utili anche per predire la risposta al trattamento farmacologico. Un’analisi dell’espressione genica mediante cDNA microarrays in pazienti con carcinoma polmonare sottoposti a chemioterapia classica a base di platino ha messo in evidenza un ristretto numero di geni, la cui espressione si associava significativamente con la risposta dei pazienti al trattamento. Inoltre, sono stati evidenziati fattori molecolari di resistenza più frequentemente presenti nei pazienti con NSCLC rispetto ai pazienti con microcitoma (26). Più recentemente, sono state condotte analisi del profilo di espressione genica in relazione ad alterazioni genomiche associate alla risposta ad inibitori delle tirosino-chinasi, quali le mutazioni di EGFR e K-ras e sono stati identificati clusters di proteine iperespresse in presenza di mutazioni di EGFR, associate a forme tumorali responsive (27).
Analisi comparative dei risultati ottenuti in questi studi molecolari ad alta processività hanno talora, mostrato bassi livelli di concordanza (28 30). Queste divergenze nei risultati possono essere dovute in parte ad approcci metodologici diversi, in parte a una serie di problemi tecnici insiti nella nuove tecnologie utilizzate. Infatti, l’elevata processività delle metodiche, i numerosi parametri coinvolti e le molteplici fasi suscettibili di errore possono inficiare la riproducibilità delle analisi. Pertanto, i risultati finora prodotti debbono essere considerati molto promettenti, ma preliminari. Nei prossimi anni, i numerosi dati disponibili dovranno essere validati in studi prospettici su ampie casistiche.