Basi Scientifiche per Linee Guida

Endometrio - 4.0 CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE

I recenti progressi nel campo della biologia molecolare hanno promosso, e continuano a promuovere, una valutazione prognostica integrata, nella quale, accanto ai fattori clinico-patologici tradizionali, trovano posto nuovi parametri biomolecolari, la cui analisi è oggettiva, riproducibile e richiede un esiguo prelievo di tessuto tumorale (Tabella 1).
Presupposto razionale per una valutazione prognostica biomolecolare è il concetto che l’acquisizione da parte delle cellule neoplastiche di un fenotipo maligno (crescita eccessiva, invasività locale, metastatizzazione) avvenga attraverso un processo multistep, cui corrisponderebbe, a livello molecolare, un progressivo accumulo di hit, cioè di lesioni a carico di geni importanti per il controllo della crescita, per l’angiogenesi, per i processi di invasione e di metastatizzazione tumorale.
Il decorso clinico del cancro dell’endometrio sembrerebbe correlarsi qualitativamente e quantitativamente alle alterazioni biomolecolari presenti in ogni sua singola cellula; viceversa, la valutazione e la caratterizzazione di specifici pattern di anomalie genetiche, cromosomiche o bioumorali, dovrebbe poter predire il comportamento biologico del tumore e perciò il destino della paziente.
Per quanto riguarda il meccanismo eziopatogenetico, che provoca la serie di trasformazioni che portano al carcinoma dell’endometrio, è noto che una prevalenza estrogenica a livello endometriale determina un aumento dell’attività mitotica che, a sua volta, rende più probabili mutazioni cancerose quali l’attivazione di oncogeni o di geni onco-soppressori, responsabili della trasformazione maligna dell’endometrio.
Gli oncogeni derivano dalla mutazione dominante di loci che controllano importanti funzioni cellulari (proto-oncogeni) e che, in virtù di questa alterazione, acquisiscono la proprietà di produrre segnali anomali, responsabili di una proliferazione e di un differenziamento cellulare altrettanto anomalo.
Alcune fra le mutazioni oncogenetiche più frequentemente registrate nei carcinomi endometriali sembrano associarsi significativamente a fattori prognostici negativi e sono state, pertanto, proposte quali parametri addizionali predittivi di una prognosi infausta.


Tabella 1 Fattori prognostici biomolecolari nel carcinoma endometriale



Recettori ormonali steroidei
La determinazione del contenuto di recettori ormonali estrogenici e progestinici nel tessuto tumorale ha rappresentato il primo tentativo di caratterizzare l’aggressività del carcinoma endometriale da un punto di vista biologico.
In questo senso, gli estrogeni sembrano agire più promuovendo la formazione del tumore che come carcinogeni in senso stretto.
E’ stato ipotizzato che l’Estradiolo esplichi, oltre ad un’attività mitotica, anche una debole azione in senso cancerogeno e mutageno capace di indurre lesioni genetiche a bassa frequenza (1). Secondo questa ipotesi, le alterazioni tumorali iniziali potrebbero essere provocate dalla conversione metabolica dell’Estradiolo a 4-idrossi-Estradiolo, che verrebbe successivamente attivato in un prodotto intermedio reattivo semiquinone-quinone, capace di danneggiare il DNA cellulare. Il tumore si svilupperebbe quindi dall’ulteriore proliferazione di queste cellule danneggiate, mediata dalla presenza del recettore ormonale.
Mentre risultano inoppugnabili le prove che legano l’origine del carcinoma dell’endometrio di tipo I all’iperplasia atipica di lunga durata, gli eventi cellulari molecolari che trasformano l’iperplasia atipica in carcinoma endometriale sono tuttora sconosciuti.

Oncogeni
Sembrerebbe che le mutazioni puntiformi a carico dell’oncogene KRAS, oncogene appartenente ad una famiglia di proteine ad attività GTPasica coinvolte nella trasduzione intracellulare del segnale proliferativo, identificate sia nel carcinoma dell’endometrio (10-30%) sia nell’iperplasia endometriale, possano rappresentare eventi precoci nello sviluppo del carcinoma dell’endometrio.
Un’aumentata espressione di ErbB-2/neu, oncogene codificante per un recettore di membrana implicato nella trasduzione del segnale mitogeno, è stata riscontrata nel 10-15% dei casi di carcinoma dell’endometrio di tipo I (2). Fra gli oncogeni, vanno ricordati anche numerosi fattori di crescita polipeptidici, implicati nella regolazione autocrina e paracrina della proliferazione endometriale, per i quali è stato proposto un importante ruolo patogenetico e prognostico nel cancro dell’endometrio.
Mutazioni di geni che codificano per fattori di crescita o per i loro recettori specifici potrebbero rendere questi geni "oncogenetici", innescando una proliferazione cellulare accelerata, fortemente a rischio per l’insorgenza di nuove mutazioni spontanee.

Oncosoppressori
Gli oncosoppressori sono, invece, geni codificanti per proteine variamente dislocate lungo le vie di trasduzione di segnali antiproliferativi. Pur avendo un’azione opposta a quella dei proto-oncogeni, quando colpiti da mutazioni recessive inattivanti, questi geni inducono una crescita cellulare afinalistica e deregolata. Per alcuni oncosoppressori, è stato ipotizzato un qualche ruolo predittivo del comportamento biologico del carcinoma endometriale.
La perdita omozigote o la mutazione dell’oncosoppressore p53, proteina nucleare coinvolta nei meccanismi di risposta cellulare allo stress citotossico, è stata, ad esempio, associata ad istotipi aggressivi, a neoplasie in stadio avanzato e ad una ridotta sopravvivenza globale.
La rarità delle mutazioni della proteina p53 nel carcinoma dell’endometrio di tipo I e la loro assenza nell’iperplasia endometriale atipica sembrerebbero suggerire che le mutazioni della p53 non siano coinvolte nella trasformazione della iperplasia endometriale atipica in carcinoma endometriale (3). Dal momento che la conversione di quest’ultima in carcinoma richiede sicuramente mutazioni multiple, la persistenza di una normale funzione della p53 in queste lesioni può spiegare perché lo sviluppo del carcinoma dell’endometrio di tipo I sia lento rispetto a quello di tipo sieroso, nel quale la perdita della funzione di p53 è un evento precoce.
Anche PTEN sembrerebbe essere coinvolto nei meccanismi di carcinogenesi del carcinoma dell’endometrio. L’inattivazione dell’anti-oncogene PTEN, infatti, rappresenta il più comune difetto genetico nel carcinoma dell’endometrio; tale inattivazione viene osservata in oltre l’83% dei tumori. PTEN è una fosfatasi che agisce in opposizione a PI3K, una chinasi che fosforila AKT, attivandola. AKT fosforilata, a sua volta, favorisce la proliferazione cellulare, la progressione del ciclo cellulare e l’inibizione dell’apoptosi.

Antigeni correlati al ciclo cellulare
Mutazioni della β-catenina sono state osservate nel 25-38% dei casi di carcinoma endometriale di tipo I.
La β-catenina è una componente del sistema E-caderina-catenina, fondamentale per la differenziazione cellulare e per il mantenimento della normale architettura tissutale e gioca un ruolo importante nella trasduzione del segnale. L’aumento dei livelli nucleari di β-catenina produce l’attivazione di geni che attivano la proliferazione cellulare (LEF/TCF) (4). La mutazione della β-catenina potrebbe rappresentare un primo step della carcinogenesi del carcinoma endometriale. In analogia al carcinoma del colon, più geni potrebbero essere potenziati dalla disregolazione del pathway della β-catenina.

Instabilità dei microsatelliti
Conflittuali restano gli studi che ipotizzano un ruolo prognostico nel cancro dell’endometrio, per l’instabilità microsatellitare, condizione caratterizzata da multipli errori nella replicazione di sequenze geniche ripetute, relativi a mutazioni geniche od epigenetiche a carico di un’altra categoria di oncosoppressori, noti come "DNA mismatch repair genes", cioè geni addetti alla regolazione dei processi di riparo del danno al DNA. Anomalie a carico di questi geni influenzano, indirettamente, la carcinogenesi, interferendo con la capacità dell’organismo di riparare danni genetici non letali e determinando così l’accumulo di mutazioni predisponenti alla trasformazione neoplastica.

COX-2
Altro ruolo importante nella progressione tumorale nel cancro dell’endometrio è stato attribuito all’incremento della COX-2 (Cyclooxygenase 2).
In particolare, si è osservato che COX-2 è over-espressa nell’iperplasia endometriale e nel carcinoma dell’endometrio, rispetto all’endometrio normale.
E’ stato già recentemente dimostrato che i livelli di questo enzima risultano aumentati anche in altre neoplasie, quali quella del colon, della prostata ecc.
Nel cancro del colon, ad esempio, è noto che l’aumentata espressione di COX-2 gioca un ruolo importante nella progressione neoplastica. Infatti, somministrando inibitori di COX-2 a pazienti con mutazione del gene APC (FAP, Familial Adenomatous Polyposis) od a topi knockout per APC si blocca la progressione da adenoma a neoplasia e si riduce il numero di adenomi.
COX-2, enzima responsabile della sintesi delle prostaglandine, potrebbe potenziare, in analogia a quanto dimostrato per il carcinoma del colon, il pathway della β-catenina. Infatti, il legame delle prostaglandine al proprio recettore transmembrana determina un cambiamento conformazionale, che attiva il complesso delle G protein.
L’attivazione della subunità α del complesso delle G protein determina il sequestro di Axina, una proteina fondamentale per l’inattivazione della β-catenina.
Non è ancora ben chiaro in che modo COX-2 intervenga nella eziopatogenesi del cancro dell’endometrio né se l’over-espressione di questo enzima possa essere correlato alle caratteristiche clinico-patologiche di questa neoplasia (stadio, istotipo, grading, grado di invasione miometriale, coinvolgimento linfonodale). Alcuni dati in letteratura (5) evidenziano un ruolo di COX-2 nel promuovere l’angiogenesi e nell’inibire l’apoptosi incrementando i livelli di BCL-2.

Proteine correlate all’apoptosi
Nell’endometrio normale, l’espressione di β-catenina, così come quella di E-caderina, è prevalente nella fase proliferativa del ciclo cellulare rispetto a quella secretiva.
Tale proteina gioca un ruolo importante nei meccanismi di trasduzione del segnale e nell’attivazione della trascrizione attraverso la formazione di complessi con proteine DNA-binding.
La proteina APC down-regola i livelli di β-catenina. Tale proteina, infatti, crea un complesso ternario con Axina e GSK-3B, che fosforila β-catenina e ne determina la degradazione attraverso un protesoma ubiquitina-dipendente (6).
Nel cancro dell’endometrio, l’espressione di β-catenina di membrana e di E-caderina diminuiscono rispetto all’endometrio normale in fase proliferativa.
Inoltre, l’espressione di tale proteina si riduce ulteriormente nei tumori ad alto grado rispetto a quelli di basso grado. Al contrario, l’espressione nucleare di β-catenina è stata osservata sia nell’endometrio normale in fase proliferativa sia nei tumori endometriali ad alto grado.
Da alcuni risultati, inoltre, è emerso che l’espressione nucleare di β-catenina è associata ad una minore espressione di E-caderina, in particolare nei tumori ad alto grado.

Densità microvascolare
Numerosi sono gli studi che documentano una correlazione positiva fra "densità microvascolare e/o macrofagica", stadio, tassi di recidiva e prognosi infausta nel carcinoma endometriale.
Interessanti appaiono gli studi che valutano alterazioni nell’espressione di enzimi proteolitici (Catepsina D), componenti della membrana basale (laminine) e proteine della matrice extracellulare (E-caderine), quali parametri predittivi di fenomeni prognosticamente sfavorevoli come l’invasione stromale, la migrazione e l’impianto a distanza di cellule tumorali.
L’analisi quantitativa del contenuto in DNA ("DNA ploidia") delle cellule neoplastiche rappresenta un ulteriore strumento per la caratterizzazione prognostica del cancro dell’endometrio e di molte altre neoplasie solide.
Anomalie nel controllo della proliferazione cellulare determinerebbero, in circa un terzo dei carcinomi endometriali, l’instaurarsi di una condizione di "instabilità", caratterizzata, a livello molecolare, da aberrazioni cromosomiche numeriche e/o strutturali, predittive di una precoce acquisizione di caratteri di malignità, a livello fenotipico. Numerosi studi hanno confermato l’impatto prognostico negativo esercitato da un contenuto aneuploide di DNA tumorale, riportandone una significativa associazione con parametri tradizionalmente predittivi di una prognosi sfavorevole, quali un istotipo aggressivo, un alto indice di recidiva ed una bassa sopravvivenza globale.
Non mancano, tuttavia, in letteratura, studi che giungono a risultati del tutto contrastanti, lasciando da chiarire il reale valore patogenetico e prognostico della presenza e del tipo di aneuploidia nel carcinoma dell’endometrio.
In definitiva, si può quindi ipotizzare, nel caso del carcinoma dell’endometrio di tipo I, un’eziopatogenesi secondo la quale la neoplasia si sviluppa lentamente a partire da precursori (endometrio iperplastico per effetto della stimolazione estrogenica), che vanno incontro a mutazioni multiple e manifestano un grado sempre più elevato di atipie arichitetturali e citologiche.
In questa visione, si ritiene che la conservazione della funzione di p53 possa inibire una rapida espansione clonale delle cellule mutate e, quindi, spiegare la lentezza dello sviluppo del tumore.
Dal punto di vista eziologico, i carcinomi dell’endometrio tipo II non presentano alcuna relazione, contrariamente a quanto avviene per il carcinoma endometriale di tipo I, con una iperstimolazione estrogenica comunque verificatasi (esogena od endogena).
In queste pazienti, i livelli ematici di estrogeni ed androgeni sono del tutto simili a quelli misurabili nei controlli, mentre risultano elevate le concentrazioni ematiche di SHBG, la proteina che riduce la quota biologicamente attiva degli estrogeni.
I soli fattori di rischio che oggi possono essere proposti per questo tipo di carcinoma endometriale sono l’età e l’esposizione a radiazioni sulla pelvi (7).
Sia l’età sia l’irradiazione pelvica potrebbero agire determinando, nelle cellule endometriali, un sempre maggior numero di mutazioni capaci di portare alla trasformazione maligna dell’endometrio.
Nelle pazienti particolarmente anziane potrebbe inoltre giocare un ruolo la diminuzione della capacità di risposta del sistema immunitario.
Dati riguardanti la cinetica delle cellule tumorali stanno emergendo quali importanti parametri di valutazione nella caratterizzazione prognostica del carcinoma endometriale. L’abnorme capacità di accrescimento che caratterizza, fenotipicamente, le neoplasie maligne, è determinata da un’alterazione di quell’equilibrio fra proliferazione e perdita di cellule, che è alla base del mantenimento dell’omeostasi tissutale.
Indici proliferativi come la stima citoflussimetrica della frazione di cellule tumorali impegnate nella sintesi nucleotidica (S-phase fraction) o le metodiche immunoistochimiche, che rilevano nell’espressione di antigeni correlati al ciclo cellulare alterazioni indicative della capacità proliferativa del tumore, sembrano significativamente associati ai tradizionali fattori prognostici clinico-patologici per il carcinoma dell’endometrio.
Controversa resta invece l’ipotesi che l’attivazione di oncogeni implicati nei segnali di sopravvivenza (BCL-2) o la ridotta espressione di fattori pro-apoptotici (BAX), possano essere realmente predittivi di un comportamento biologico aggressivo della neoplasia.
Degna di nota, per quanto ancora in fase precoce di analisi, è la possibilità che fattori bioumorali e molecolari implicati in tappe cruciali della progressione tumorale quali la neoangiogenesi, l’invasione stromale e la metastatizzazione possano rappresentare dei nuovi, addizionali parametri di valutazione nella caratterizzazione prognostica del tumore.


BIBLIOGRAFIA

1. Liehr JG. Is estradiol a genotoxic mutagenic carcinogen? Endocr Rew 2000; 17:40-54

2. Li S, Chen J et al. N-Myc downstream- regulated gene 1 as a downregulated target gene of PTEN in the controlling of tumorigenesis in endometrioid carcinoma. Indian J Med Res 2008 May; 127(5):453-9

3. Mutter GL, Lin MC et al. Altered PTEN expression as diagnostic marker for the earliest endometrial precancers. J Natl Cancer Inst 2000; 92:924-31

4. Jonathan L, Hecht JL et al. Molecular and pathologic aspects of endometriale carcinogenesis. J Clin Oncol 2006; 24(29):4783-91

5. Ohono S, Ohono Y et al. Multiple role of Cyclooxygenase-2 in endometrial cancer. Anticancer Reserch 2005; 25:3679-88

6. Hsien-Chang S, Tanri S et al. Immunohistochemical expression of E-cadherin and B-catenin in the normal and malignant human endometrium: an inverse correlation between E-cadherin and nuclear B-catenin expression. Anticancer Research 2004; 24:3843-50

7. Fujisawa T, Hamano M et al. Establishment and characterization of two different types of new human endometrial adenocarcinoma cell lines (HEC-251 and HEC-265). Eur J Gynaecol Oncol 2004; 25(3):299-304