Regolazione della tempistica della replicazione del DNA

La tempistica della replicazione del DNA (DNA replication timing, RT) si riferisce allo specifico ordine temporale con cui le diverse regioni del genoma vengono replicate durante la fase S del ciclo cellulare. Questo processo è altamente regolato e può variare tra diversi tipi cellulari e stadi di sviluppo. La comprensione del RT è fondamentale perché è associato a numerosi processi biologici, tra cui la regolazione dell'espressione genica, l'organizzazione 3D e il rimodellamento della cromatina, la stabilità del genoma, gli stati patologici come il cancro. La caratterizzazione del RT a livello molecolare è limitata. E’ noto che i loci cromatinici a replicazione precoce sono ricchi di geni, trascrizionalmente attivi e localizzati all’interno del nucleo. Al contrario le regioni a replicazione tardiva sono in gran parte povere di geni e distribuite preferenzialmente vicino alla membrana nucleare. La difficoltà ad approfondire gli studi sul RT è dovuta in gran parte alla scarsità di modelli sperimentali in cui il RT possa essere completamente abrogato. Il nostro gruppo da molti decenni studia i meccanismi molecolari che regolano il ciclo cellulare nelle cellule terminalmente differenziate (TD) e recentemente ha scoperto che le cellule muscolari TD  (miotubi, MT) sono un eccellente modello per studiare il RT. I miotubi, infatti, possono essere indotti a replicare il DNA in presenza oppure in assenza di RT in dipendenza del tipo di stimolo applicato: l’espressione dell’oncogene adenovirale E1A (MT-E1A) induce la sintesi di DNA con un canonico RT, mentre la rimozione degli inibitori del ciclo cellulare p21 e p27 (MT-CKIi) produce una fase S priva di RT. Utilizzando i MT abbiamo capito che l’acetil-transferasi, co-fattore trascrizionale p300/CBP è un regolatore del RT. I nostri dati preliminari mostrano che la presenza del RT nei MT-E1A dipende dalla capacità di E1A di legare p300/CBP. Inoltre se p300/CBP viene abrogato in MT-CKIi si assiste al ripristino del RT canonico. L’attività acetil-transferasica di p300/CBP influenza diversi processi cellulari (la proliferazione, il differenziamento e l'apoptosi) e la sua deregolazione è implicata in vari tipi di cancro tra cui il rabdomiosarcoma. Recentemente è stato pubblicato che il RT è profondamente coinvolto nel processo di traslocazione oncogenica. Inoltre la proteina di fusione PAX3-FOXO1, marcatore del rabdomiosarcoma alveolare, utilizza il suo dominio di attivazione per reclutare il p300/CBP e modellare la distribuzione del cluster trascrizionale essenziale per la trasformazione oncogenica. 

Scopo del lavoro 

Allo scopo di caratterizzare il ruolo di p300/CBP nella regolazione del RT studiamo come l’occupazione dei loci genomici da parte di questa acetil-transferasi influenza il loro RT, la posizione topologica all’interno del nucleo e la trascrizione dei geni in essi compresi. Attraverso esperimenti di ChIP-seq nei MT non trattati selezioniamo le regioni cromatiniche che sono occupate da p300/CBP e che subiscono ampi cambiamenti di RT nei MT-CKIi rispetto al canonico RT dei MT-E1A. Lo spostamento di tali regioni dalla periferia al centro del nucleo (e viceversa) viene valutato attraverso la FISH. Analisi di RNA-seq vengono condotte per misurare l’abbondanza di mRNA dei geni compresi nelle regioni interessate. Le conoscenze acquisite nel nostro sistema ideale dei MT saranno successivamente utilizzate per identificare il coinvolgimento di p300/CBP nella regolazione del RT in cellule tumorali, in particolare nei rabdomiosarcomi alveolari.