Le competenze dell’Unità di virologia del Reparto di Zoonosi Emergenti del Dipartimento di Sicurezza Alimentare, Nutrizione e Sanità Pubblica Veterinaria (SANV), riguardano i patogeni virali umani e animali. Le attività di ricerca e diagnosi sono svolte mediante comuni tecniche di biologia cellulare e molecolare. L’obiettivo delle attività svolte è l’identificazione e la tipizzazione (definizione del genotipo, sottotipo o sierotipo) dei ceppi virali. In particolare, i virus oggetto delle attività dell’unità di virologia sono: rotavirus (RV), norovirus (NoV) [https://www.epicentro.iss.it/norovirus/], norovirus murino (MNV), sapovirus (SaV), astrovirus (AstV), adenovirus (AdV, PAdV), virus dell’epatite E (HEV), torque teno virus (TTV, TTSuV) e coronavirus (CoV).
L’identificazione dei virus viene effettuata tramite:
- metodi di biologia cellulare (isolamento virale su cellule, siero-neutralizzazione)
- metodi molecolari (PCR, RT-PCR, real-time RT-PCR, qPCR, multiplex nested PCR)
- metodi immunologici (ELISA, Western-blotting, immunoprecipitazione, immunocitochimica e immunofluorescenza).
Vengono utilizzate tecniche di biologia avanzata per la tipizzazione dei virus:
- metodi molecolari (sequenziamento nucleotidico, next generation sequencing NGS)
- metodi bioinformatici (filogenesi, filodinamica, metodi bayesiani).
Per gli studi sui caratteri antigenici, di virulenza e patogenicità, sull’evoluzione e trasmissione zoonotica dei virus, oltre ai metodi bioinformatici per l’analisi delle sequenze nucleotidiche e aminoacidiche, vengono impiegati anche animali da laboratorio (topi, conigli) per la produzione di sieri iperimmuni e anticorpi monoclonali e per saggi di protezione in vivo. L’unità di virologia del Reparto di Zoonosi emergenti ha competenza specifica per l’analisi filogenetica del genoma virale, attraverso l’uso di database di sequenze proprie o presenti in database condivisi a livello Europeo (HEVNet typing tool; NoroNet typing tool; RotaC typing tool), per il clonaggio di geni e l’espressione di proteine ricombinanti virali (per usi diagnostici o vaccinali).
L’unità di virologia del Reparto partecipa a progetti nazionali ed europei che si occupano di sorveglianza epidemiologica di patogeni virali umani RV (EuroRotaNet), NoV (NoroNet) e zoononotici HEV (HEVnet; EJP, MedVetNet). Le attività sono prevalentemente svolte in collaborazione con altri Enti del SSN e Università, OMS, Network Europei, e includono corsi di addestramento e partecipazione a Ring Trials.
In particolare l’unità di virologia del Reparto di Zoonosi Emergenti partecipa in ambito europeo al network NoroNet (https://www.rivm.nl/en/noronet) e dal 2007 al Rotavirus Surveillance Network (https://www.eurorotanet.com/) con l’obiettivo di valutare la circolazione di genotipi o varianti virali sul territorio nazionale. Tale attività è svolta mediante la riconferma diagnostica e la caratterizzazione molecolare dei ceppi di norovirus (NoV) e rotavirus (RV) identificati in campioni biologici (feci e/o vomito) umani e animali.
Metodologia
I campioni biologici (feci e/o vomito) umani e animali per la riconferma diagnostica di rotavirus e/o norovirus, vengono sottoposti ad analisi mediante tecniche di biologia molecolare (retro-trascrizione- PCR; RT-PCR) utilizzando metodiche standardizzate a livello Europeo:
Per i NoV, la RT-PCR utilizzata amplifica una regione diagnostica conservata della ORF1 (RNA polimerasi RNA dipendente, RpRd) e una regione conservata della ORF2 (proteina VP1 capsidica).
Per i RV, la RT-PCR utilizzata amplifica due geni del genoma virale che codificano per le proteine del capside VP7 e VP4 (che determinano rispettivamente i genotipi G e P) seguita da una semi nested PCR specifica per i genotipi virali maggiormente diffusi.
Il campione biologico per le analisi insieme ed alcune informazioni clinico-epidemiologiche (come da allegato Questionario A) può essere inviato seguendo le istruzioni riportate nell'apposito allegato alla presente pagina (definizione di caso e protocollo per la raccolta e spedizione dei campioni biologici).
Definizione di caso e protocollo per la raccolta e spedizione dei campioni biologici
i. Il caso è un paziente (tutte le fasce di età) che presenta sintomi quali vomito e/o diarrea (2 o più scariche/die e/o vomito a “proiettile”).
L’oggetto della richiesta deve essere: conferma diagnostica per norovirus e/o rotavirus.
ii. Il campione di feci (˜1 g o 1 ml) e/o vomito (˜0,5 ml o tampone mediante garza sterile), deve essere raccolto possibilmente durante la fase acuta o comunque entro 1 settimana dall’episodio. I campioni (NON DILUITI/ non aggiungere terreni o soluzioni) saranno conservati a 4°C per <3 giorni o congelati a -20°C per periodi prolungati prima di essere analizzati o inviati all’Istituto Superiore di Sanità.
iii. I campioni analizzati (feci e/o vomito) risultati positivi per la ricerca di batteri enterici e/o tossine NON devono essere inviati. I campioni positivi per norovirus e/o rotavirus possono essere inviati per la conferma diagnostica e la tipizzazione del ceppo virale.
Si richiede, possibilmente, di raccogliere alcune informazioni clinico-epidemiologiche nel Questionario A.
Le infezioni da rotavirus e norovirus possono colpire anche gli animali (bovini, cavalli…), il reparto effettua lo stesso tipo di indagine anche sui campioni biologici animali.
Per la spedizione prendere contatto con:
Dr.ssa Monini: marina.monini@iss.it (tel. 0649902673)
Dr.ssa Di Bartolo: ilaria.dibartolo@iss.it (tel.0649902787)
Dr. Ianiro: giovanni.ianiro@iss.it (tel.0649902323)
